PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：

1、引物長度約為16-30 bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。

2、引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

3、四種堿基應(yīng)隨機分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。

4、引物3'端好與目的序列閱讀框架中密碼子第1或第2位核苷酸對應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。

5、在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。

6、兩引物之間尤其在3'端不能互補， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。兩引物間好不存在 4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。

7、引物5'端對擴增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖 體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。

8、引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴增，影響產(chǎn)量。

9、簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。

10、一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體， 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計， 可精 確計算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計算：

X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個數(shù)。